圖解中國藥典控制菌檢查法（二）
 

　　方法適用性試驗(yàn)
 

　　試驗(yàn)菌：根據(jù)供試品所需檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株，確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí)，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。
 

　　依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出相應(yīng)控制菌。
 

　　若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性[見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)中的“抗菌活性的去除或滅活”]，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。
 

　　如果經(jīng)過試驗(yàn)確證供試品對試驗(yàn)菌的抗菌作用無法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對*的方法進(jìn)行供試品的檢查。
 

　　
 

　　供試品檢查
 

　　供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。
 

　　陽性對照：對照菌的加量應(yīng)不大于100cfu，應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。【耐膽鹽革蘭陰性菌檢查中的陽性對照株使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌；梭菌檢查中的陽性對照株使用生孢梭菌】
 

　　陰性對照：以稀釋劑代替供試液，應(yīng)無菌生長。如果有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。
 

　　
 

　　3.1耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)
 

　　簡述：耐膽鹽革蘭陰性菌是指能夠耐受膽鹽，在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長的革蘭陰性桿菌，一般包括腸桿菌科、假單胞菌屬、氣單胞菌屬等。其作為衛(wèi)生指標(biāo)，與大腸菌群有類似的指示作用。對于非無菌產(chǎn)品而言，檢出耐膽鹽革蘭陰性菌或超標(biāo)，指示生產(chǎn)工藝存在缺陷、原輔料受到污染、生產(chǎn)、儲運(yùn)緩解微生物污染控制措施失效等。
 

　　在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長的革蘭陰性桿菌
 

　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定選擇定性或定量方法。若標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為“不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌”，則選擇“定性試驗(yàn)”檢驗(yàn)；若標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為“耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)<10n cfu/g(ml)”，則選擇“定量試驗(yàn)”檢驗(yàn)。
 

　　試驗(yàn)步驟如下圖：
 

　　通過選擇性增菌，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌應(yīng)為革蘭陰性菌，但仍需進(jìn)行革蘭染色進(jìn)行確認(rèn)。
 

　　陽性對照試驗(yàn)使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌，并在接種EE的步驟加入對照菌。
 

　　培養(yǎng)基：
 

　　3.2大腸埃希菌（Escherichia coli）
 

　　簡述：大腸埃希菌為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌，表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染，即可能污染腸道病原體。除普通大腸埃希菌外，尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。
 

　　試驗(yàn)步驟如下圖：

 

　　大腸埃希菌檢查應(yīng)鑒定到“種”水平。
 

　　麥康凱液體的培養(yǎng)溫度為42~44℃，因?yàn)樵摋l件是區(qū)分大腸埃希菌和大腸菌群其他“種”的關(guān)鍵條件，另外有文獻(xiàn)報(bào)道表明：受到人和溫血?jiǎng)游锛S便污染的大腸埃希菌在42~44℃更容易生長。
 

　　大腸埃希菌在麥康凱瓊脂中的典型菌落形態(tài)特征：鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。
 

大腸埃希菌在麥康凱瓊脂上
 

　　結(jié)果與判定：MUG和靛基質(zhì)試驗(yàn)可以作為確認(rèn)的參考方法。IMViC試驗(yàn)亦可以作為鑒定和確認(rèn)的參考。
 

　　培養(yǎng)基：
 

 

　　3.3沙門菌（Salmonella）
 

　　簡述：沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌。在沙門菌的分類學(xué)研究和流行病學(xué)研究中，按照血清型進(jìn)行分類更為常見，一般來說，O抗原抗血清的A-E群包含了沙門菌分離株的95%，所以可以用沙門菌A-F O多價(jià)血清進(jìn)行沙門菌初篩試驗(yàn)。
 

　　試驗(yàn)步驟如下圖：

 

藥品中的沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準(zhǔn)。
 

　　與其他控制菌相比，沙門菌檢查的取樣量較大(10g或10mL的供試品)，經(jīng)方法適用性試驗(yàn)，可適當(dāng)增加TSB的體積，消除可能的抑菌作用。
 

　　使用RV培養(yǎng)基應(yīng)控制預(yù)增菌液的加入量，一般要求1:100 ~1:2000之間。
 

　　沙門菌在XLD中典型菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。使用XLD時(shí)需注意：①培養(yǎng)超過48h可能造成某些微生物的假陽性；②某些變形桿菌菌株可能會(huì)出現(xiàn)黑心菌落；③甲型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌可能會(huì)形成無黑心紅色菌落，與志賀氏菌混淆。
 

　　在TSI高層斜面試驗(yàn)中，建議同時(shí)接種沙門菌、大腸埃希菌或其他類似腸桿菌科的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對照菌，輔助判斷斜面和底層的顏色反應(yīng)。
 

　　沙門菌利用培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)酸使斜面先變黃，生成的少量酸接觸空氣氧化，同時(shí)利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，使斜面變紅。底層在缺氧狀態(tài)下，細(xì)菌分解葡萄糖生成的酸類一時(shí)不被氧化而仍保持黃色。
 

　　培養(yǎng)基：
 

　　3.4銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
 

　　簡述：銅綠假單胞菌為假單胞菌屬菌種，本菌是常見的化膿性感染菌，在燒傷、燙傷、眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，優(yōu)于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度，國內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查被列為外用制劑的檢查項(xiàng)目之一。
 

　　試驗(yàn)步驟如下圖：
 

 

　　銅綠假單胞菌檢查應(yīng)鑒定到“種”水平。
 

　　溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(以下簡稱“CA”)上若有菌生長，均需要鏡檢鑒定。典型的銅綠假單胞菌在CA上形成藍(lán)綠色菌落，在254nm的紫外燈下顯熒光；有個(gè)別株不產(chǎn)綠膿菌素，但在254nm的紫外燈下仍顯熒光。
 

　　銅綠假單胞菌在CA上

 

　　若需要進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，可以進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42℃生長試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)，判定如下圖。
 

 

培養(yǎng)基： 

 

　　3.5金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
 

　　簡述：金黃色葡萄球菌為葡萄球菌屬中的一種。本菌可產(chǎn)生多種毒素及酶，這些毒性物質(zhì)能引起局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成為敗血癥和膿毒血癥，是人類化膿性感染中重要的病原菌。金黃色葡萄球菌檢查是外用制劑的檢查項(xiàng)目之一。
 

　　試驗(yàn)步驟如下圖：
 

 

　　金黃色葡萄球菌檢查應(yīng)鑒定到“種”水平。
 

　　典型的金黃色葡萄球菌在MSA上呈黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落，而表皮葡萄球菌則能使培養(yǎng)基呈紅色。菌落呈黃色表示該菌很可能血漿凝固酶呈陽性，而菌落呈紅色則表示血漿凝固酶呈陰性。
 

　　除MSA外，還可以將疑似菌落劃線至Baird-Parker平板和血平板上。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2~3mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色(非白色)的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰帶。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時(shí)為白色)，菌落周圍可見*透明溶血圈。
 

　　確證的關(guān)鍵試驗(yàn)為血漿凝固酶試驗(yàn)，注意需同時(shí)進(jìn)行陽性對照(金黃色葡萄球菌菌懸液)和陰性對照試驗(yàn)(空白培養(yǎng)液或稀釋液)。
 

　　選擇性平板上為典型菌落，革蘭陽性球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，則判檢出金黃色葡萄球菌。

 

金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上
 

　　培養(yǎng)基：
 

　　3.6梭菌（Clostridia）
 

　　簡述：梭菌屬主要病原菌有：產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌等，均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素使人和動(dòng)物治病。因此對于某些用于陰道、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品，必須控制梭菌。
 

　　試驗(yàn)步驟如下圖：

 

　　梭菌檢查需鑒別到“屬”水平。
 

　　梭菌屬細(xì)菌芽孢體對外界的抵抗力強(qiáng)，耐高溫耐干燥，對新霉素、卡拉霉素、慶大霉素等抗生素不敏感。因此將供試液在80℃保溫10分鐘后迅速冷卻，以殺死可能存在的雜菌繁殖體，使梭菌具有優(yōu)勢生長；或在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基中加入慶大霉素，抑制雜菌，利于梭菌的分離培養(yǎng)。
 

　　梭菌革蘭染色鏡檢的典型形態(tài)特征為：培養(yǎng)后形成的芽孢，初呈“火柴頭”狀卵圓形，繼而膨大呈球形，在菌體末端如鼓槌狀。培養(yǎng)72小時(shí)以上時(shí)，菌體可自溶而消失，僅見游離的芽孢囊，一般染色時(shí)呈圓圈狀。染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢，大于菌體，著生于菌體中央、次端或頂端，為梭菌典型形態(tài)。
 

　　鑒別梭菌的關(guān)鍵生化反應(yīng)為過氧化氫酶試驗(yàn)，梭菌應(yīng)呈陰性(無氣泡形成)，可用枯草芽孢桿菌作為陽性對照(有氣泡形成)。
 

　　培養(yǎng)基：

 

　　簡述：白色念珠菌又名白假絲酵母菌，屬假絲酵母菌屬。白色念珠菌是條件致病菌，是醫(yī)學(xué)全身性真菌感染病的重要組成之一，一旦感染，?？梢鹦膬?nèi)膜炎、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，目前國內(nèi)外藥品、食品標(biāo)準(zhǔn)已把白色念珠菌作為微生物檢驗(yàn)中酵母菌的代表均，因此有些藥品依據(jù)給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。
 

　　試驗(yàn)步驟如下圖：
 

　　白色念珠菌檢查應(yīng)鑒定到“種”水平。
 

　　白色念珠菌在SDA中呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑，有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有褶皺。
 

         培養(yǎng)基：

 

 

　　a.如果陽性對照試驗(yàn)中陽性菌未生長，則表明檢驗(yàn)方法或檢驗(yàn)過程存在干擾因素，應(yīng)判斷無效，并進(jìn)行偏差調(diào)查，調(diào)查的因素包括培養(yǎng)基的配制、滅菌、培養(yǎng)基的適用性檢查、試驗(yàn)器具的滅菌、檢驗(yàn)的潔凈環(huán)境、人員操作、方法適用性試驗(yàn)等。
 

　　b.如果陰性對照試驗(yàn)有菌生長，表明試驗(yàn)過程存在污染可能，試驗(yàn)結(jié)果無效，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查，調(diào)查的因素包括培養(yǎng)基的配制、滅菌、試驗(yàn)器具的滅菌、檢驗(yàn)的潔凈環(huán)境、人員操作等。
 

　　c.在檢驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)有控制菌或不可接受微生物的檢出，則認(rèn)為是超標(biāo)或異常檢驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)立即啟動(dòng)OOS調(diào)查。對于藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)而言，OOS調(diào)查即實(shí)驗(yàn)室調(diào)查，包括影響檢驗(yàn)結(jié)果的所有因素，如試驗(yàn)人員、試驗(yàn)方法、取樣程序、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試驗(yàn)器具、培養(yǎng)基、試驗(yàn)環(huán)境等，隨著調(diào)查結(jié)果和流程，可以延伸到其他部門。對于生產(chǎn)企業(yè)而言，OOS調(diào)查包括實(shí)驗(yàn)室調(diào)查和生產(chǎn)環(huán)節(jié)調(diào)查。實(shí)驗(yàn)室調(diào)查包括上述內(nèi)容，如果實(shí)驗(yàn)室調(diào)查認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，則應(yīng)擴(kuò)大調(diào)查至生產(chǎn)環(huán)節(jié)。一般來說，生產(chǎn)環(huán)節(jié)的調(diào)查包括檢出菌特性分析(包括來源、危害、耐受性、是否會(huì)產(chǎn)生生物膜等)、檢出菌的數(shù)量評估、檢出菌在物料或終產(chǎn)品中的生長特性分析、生產(chǎn)的某些工藝是否對檢出菌有抑制或殺滅作用、實(shí)驗(yàn)檢出相同菌的歷史調(diào)查、生產(chǎn)過程的詳細(xì)分析(包括原輔料、水系統(tǒng)以及包裝材料的檢驗(yàn)、物料的轉(zhuǎn)運(yùn)、生產(chǎn)工藝參數(shù)、包裝)等；通過生產(chǎn)調(diào)查，根據(jù)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估判斷該產(chǎn)品是否放行，并查找根本原因，制訂糾正和預(yù)防措施。
 

　　參考：
 

　　[1] 《中國藥典》2020年版四部 1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法；
 

　　[2] 《中國藥典》2020年版四部 9204微生物鑒定指導(dǎo)原則；
 

　　[3] 《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2019年版。